五味子为木兰科藤本植物五味子Schisandrachinensis ( Turcz. ) Baill 的干燥成熟果实，功能收敛固涩，益气生津，补肾宁心。《本草纲目》记载五味子“入嗽药生用，入补药熟用”，即五味子“生熟异用”。前期实验比较五味子不同炮制品对肾阳虚小鼠的影响发现，五味子对肾阳虚小鼠脏器指数、激素水平都有积极影响，且炮制后作用增强。因五味子既补肾阳又补肾阴，故本课题分别比较生熟五味子的补肾阳和补肾阴作用，以说明五味子“入补药熟用”的炮制原理。目前临床常用炮制品种有醋五味子、酒五味子、蜜五味子等，醋五味子为药典收载五味子唯一的炮制品种，但研究五味子的炮制沿革发现，醋五味子是近代新增的炮制品种，推测“入补药熟用”中的五味子可能是酒五味子。所以本实验比较五味子、醋五味子、酒五味子对肾阴虚小鼠的影响，为五味子“生熟异用”研究及临床合理应用提供依据。
1 材料
1. 1 动物KM 小鼠雌雄各半90 只，体质量18 ～22 g，由大连医科大学实验动物中心提供，动物合格证号为[SCXK ( 辽) 2008-0002]。普通饲料，定时定量喂食，自由饮水。
1. 2 药物与试剂五味子购自辽宁凤城五味子种植基地，由辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为北五味子。醋五味子制备: 取净五味子加米醋拌匀，闷润1. 5 h，蒸制5 h，50 ℃干燥至恒定质量。五味子-米醋为100 ∶ 20。酒五味子: 取净五味子加黄酒拌匀，闷润1 h，蒸制4 h，50 ℃ 干燥至恒定质量。五味子-黄酒为100 ∶ 20。氢化可的松注射液( 哈药集团制药总厂，批号H20023069)六味地黄丸( 北京同仁堂药业， 批号201209033) ，环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷、肌酐、乙酰胆碱试剂盒( 上海科兴商贸有限公司批号20120402B) 。
1. 3 仪器离心机( 上海安亭科技公司TGL-16C) ， 分析天平( 上海天平仪器厂生产FA1004B) ，酶标仪( 上海赛默飞世尔仪器有限公司MK3) 。
2 方法
2. 1 药物制备五味子水提物的制备: 分别取一定量五味子不同炮制品粗粉，加8 倍量的水浸泡0. 5 h，煎煮3 次，每次1 h，滤过，合并滤液，浓缩，制成低、高剂量组( 合生药量45、90mg /mL) 。六味地黄丸药液制备: 取六味地黄丸18 g，加入100 mL 纯净水制成0. 18 g /mL 混悬液。
2. 2 分组及给药将90 只KM 小鼠雌雄各半随机分为9 组，即空白对照组，模型对照组，阳性对照( 六味地黄丸) 组、生品低、高剂量组，醋制品低、高剂量组，酒制品低、高剂量组，每组10 只。除空白组与模型组灌胃生理盐水外，其他组灌胃相应药液，灌胃剂量均为0. 02 mL /g，连续11 d，第7 天开始除空白组外其他各组在灌胃同时腹腔注射氢化可的松注射液制造肾阴虚模型，0. 2 mL /只，连续4 d。每3 天称定质量，并记录观察精神行为状况。
2. 3 取材第10 天给药后禁食不禁水24 h，第11 天末次给药1 h 后采取摘眼球法取血约1 mL，放入EP 管中，于10 000 r /min 的离心机中离心5min，取血清于EP 管中， - 20 ℃保存备用。分离肝、脾、两侧肾脏，用生理盐水洗净，滤纸拍干，于分析天平称定质量。
2. 4 指标测量激素指标测量: 严格按照试剂盒说明书提供方法检测，经过稀释、加样、温育、洗涤、显色后于405 nm 处测定吸光度，计算即得。脏器指数测量: 脏器分析天平称定质量，按照“脏器指数= ( 脏器质量/体质量) × 1 000”进行计算。
2. 5 统计学分析测定数据用x ± s 表示，采用SPSS 12. 0 统计软件进行单因素方差分析，组间比较使用成组t 检验。
3 结果
3. 1 对cAMP、cGMP 及比值的影响模型组环磷酸腺苷( cAMP) 较空白组升高明显，环磷酸鸟苷( cGMP) 变化不明显，cAMP /cGMP 升高明显，治疗组较空白组cAMP 升高幅度较模型组减少，有显著性差异，cGMP 变化不明显，cAMP /cGMP 介于模型与空白之间，与模型组存在显著性差异。各炮制品中酒制品最好，低、高剂量间无显著性差距，低剂量略好。
3. 2 对Ach、Cr 水平的影响模型组较空白组乙酰胆碱( Ach) 降低，肌苷( Cr) 升高，差异明显，治疗组较模型组治疗效果明显，酒制品效果最好，高低剂量间无显著性差异。
3. 3 对脏器指数的影响空白组与给药组较模型组脏器指数高，酒品低剂量组效果最好，较其他组有显著性差异。
4 讨论
目前研究中常用的肾虚模型有两种，即甲状腺素肾虚模型和氢化可的松肾虚模型，对比发现甲状腺素所致模型为肾阴不足，虚火内生的甲亢肾虚模型，并非五味子主治证，故本实验采用注射氢化可的松造模。预实验中以进食量，进水量以及小鼠大便状态为指标，考察腹腔注射、皮下注射、后肢肌肉注射造模效果，腹腔注射效果最好，注射一天后小鼠进食量明显减小，进水量增加，大便干结，故选用腹腔注射。氢化可的松肾阴虚模型关键在于短程、大剂量，造模时间长容易由阴虚转阳虚，剂量小则造模不能成功，预实验过程中发现小鼠腹腔注射最大可承受剂量为0. 2 mL，超过0. 2 mL小鼠会出现立即昏厥，抽搐，甚至死亡，故剂量定为0. 2 mL。大剂量注射氢化可的松会导致大量蛋白质、脂肪水解，是一种机体的生理应激反应，表现为小鼠体质量明显下降，而治疗组体质量下降趋势较缓于模型组，五味子可减缓这种应激作用。大剂量给予氢化可的松可致全身过敏反应，实验过程中表现为小鼠眼睑肿胀，出水，模型组中6 只小鼠双眼肿胀，出水，治疗组中两组各出现一只，故五味子可以较好地缓解这种过敏症状。
环磷酸腺苷( cAMP) 、环磷酸鸟苷( cGMP)对细胞功能具有双向调节作用，通过相互拮抗作用使细胞处于稳定状态，与传统医学中的阴阳学说相似，cAMP 升高， 说明机体处于阴虚状态，cGMP 升高则为阳虚，因此cAMP /cGMP 升高则为阴虚，降低则为阳虚，是目前比较常用，也比较权威的指标。
肝脏具有多种生理功能，为体内糖的重要贮备器官。从模型组与空白组肝脏脏器指数明显差异说明采用氢化可的松造模可导致小鼠肝脏萎缩，但使用炮制品治疗后小鼠肝脏增重，说明炮制后可增强小鼠对糖类的吸收，进一步说明了五味子炮制前后功效的差异。
氢化可的松是一种强的免疫抑制剂，强烈抑制淋巴细胞增殖，进一步导致脾脏萎缩，降低小鼠免疫功能，故选择脾脏脏器指数作为对治疗作用的评价指标，从实验结果发现五味子能提高肾阴虚小鼠的免疫作用，酒制品高剂量组好。
前期查阅文献发现肾阴虚型大鼠垂体及下丘脑处于受抑制状态( 外源性激素的负反馈抑制作用) ，HPA 轴功能下降，主要表现为促肾上腺素释放激素( CRH) 减少，进而影响Ach 的分泌，故采用Ach 这一肾上腺指数为指标，检测肾阴虚小鼠的HPA 轴功能状态。
本研究证明五味子能改善氢化可的松所致肾阴虚小鼠的激素水平，提高肝肾脏器指数，对肾阴虚有一定治疗作用。其机制可能为减轻对肾脏的损害，从而使Cr 水平降低，肾脏脏器指数增加; 减小氢化可的松免疫抑制作用，保护肝脾功能; 减小HPA 轴抑制作用，增加血清中Ach 的量。本研究实验数据表明五味子低剂量组较高剂量组效果好，酒制品较其他炮制品效果好。
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